安全檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室臨床基因擴(kuò)增儀工作規(guī)范
發(fā)布時(shí)間：2013-08-09 閱讀：723次
雖然PCR儀器不是一種計(jì)量?jī)x器，但其主要作用原理與基本計(jì)量要素密切相關(guān)，要求較高，一旦失控，儀器將不能正常工作，所以PCR儀器也需要定期檢測(cè)和維護(hù)，這對(duì)依賴自然風(fēng)降溫的PCR儀器尤為重要。
為使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。
一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見(jiàn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。
清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
(一)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。
含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。
主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢查，評(píng)價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。對(duì)于“熱啟動(dòng)”技術(shù)(在個(gè)高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。
在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。
嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。
工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈(254nm波長(zhǎng))，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。
(二)標(biāo)本制備區(qū)
下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。
要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。
用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。
對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?254nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離)適合于滅活去污染?？梢苿?dòng)紫外線管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照射。
樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。
cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。
待測(cè)RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(三)擴(kuò)增區(qū)
下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。 為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。
完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。
(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。
核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前的商品試劑盒大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。
本區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意避免通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。
由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。
本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。
二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。
(一)標(biāo)本的采集
常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶性失活。
全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。
臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。
(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理
用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場(chǎng)采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對(duì)于特定的檢測(cè)項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)。
(三)標(biāo)本的運(yùn)送
標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。
(四)標(biāo)本的貯存
臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70℃下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。
(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)
標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對(duì)其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定失敗的常見(jiàn)原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對(duì)于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。
(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增
1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄
cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。
2、核酸的擴(kuò)增
有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性為重要，必須定期對(duì)擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。
(七)污染
在實(shí)際工作中，常見(jiàn)有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標(biāo)本間交叉污染(如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的主要來(lái)源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。
由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。
1、測(cè)定分析前的污染源
測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。
2、測(cè)定分析階段的污染源
通常，測(cè)定分析階段的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。
在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。
3、污染的避免
要避免污染，先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對(duì)工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。
為避免以前測(cè)定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照射，通過(guò)異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過(guò)程，所以這種方法也能防止污染。
上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然DNA的污染。
4、去除污染的措施
工作完后必須定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗(yàn)后長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面和其他表面；(3)實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。
(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析
擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測(cè)序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。
雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。
常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。
在擴(kuò)增后的雜交檢測(cè)中, 應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)給檢測(cè)信號(hào)的特異性帶來(lái)負(fù)面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。
(九)質(zhì)量控制
質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(以下簡(jiǎn)稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。
1、室內(nèi)質(zhì)量控制
必須對(duì)DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽(yáng)性和假陰性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測(cè)定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。
(1)標(biāo)本制備： 常用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長(zhǎng)度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長(zhǎng)度平均范圍為30-40kb。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見(jiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。
快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對(duì)結(jié)果有疑問(wèn),就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測(cè)定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對(duì)RNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計(jì)比色方法也不能對(duì)RNA的完整性下結(jié)論。
對(duì)于血清（漿）中病毒的測(cè)定，則要評(píng)價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標(biāo)本評(píng)價(jià)核酸提取方法的效果。
(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。
對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控方法也可采用外標(biāo)質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、β肌動(dòng)蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標(biāo)本制備時(shí)將外來(lái)內(nèi)標(biāo)加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會(huì)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。
對(duì)于DNA測(cè)定內(nèi)標(biāo)可使用對(duì)有機(jī)體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對(duì)于病原體的基因檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控每一擴(kuò)增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。
目前的商品試劑盒大部分沒(méi)采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此在測(cè)定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽(yáng)性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測(cè)臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測(cè)的效果。
使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測(cè)下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。
每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測(cè)質(zhì)控)，為判斷擴(kuò)增過(guò)程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。陰性標(biāo)本可以評(píng)估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量。
在擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過(guò)這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。
(3)板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。
(4)測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾。
結(jié)果的報(bào)告必須簡(jiǎn)單清楚。定性測(cè)定報(bào)告“陽(yáng)性”或“陰性”即可。定量測(cè)定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測(cè)定方法線性范圍上限，則對(duì)樣本稀釋后再測(cè)，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測(cè)定范圍下限，則報(bào)告<多少即可，不能報(bào)告為“0”或“陰性”。
2、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)
所有開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果將作為其開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。
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為使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。
一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見(jiàn)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。為避免污染，必須嚴(yán)格遵循《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。
清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
(一)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。
含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。
主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢查，評(píng)價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。對(duì)于“熱啟動(dòng)”技術(shù)(在個(gè)高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。
在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。
嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。
工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈(254nm波長(zhǎng))，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60~90cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。
(二)標(biāo)本制備區(qū)
下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。
要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。
用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。
對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?254nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離)適合于滅活去污染?？梢苿?dòng)紫外線管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照射。
樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。
cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。
待測(cè)RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(三)擴(kuò)增區(qū)
下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。 為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。
完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。
(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。
核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前的商品試劑盒大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。
本區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意避免通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。
由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。
本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。
二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。
(一)標(biāo)本的采集
常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶性失活。
全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。
臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。
(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理
用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場(chǎng)采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對(duì)于特定的檢測(cè)項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)。
(三)標(biāo)本的運(yùn)送
標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。
(四)標(biāo)本的貯存
臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于-70℃下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。
(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)
標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對(duì)其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定失敗的常見(jiàn)原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對(duì)于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。
(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增
1、靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄
cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。
2、核酸的擴(kuò)增
有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性為重要，必須定期對(duì)擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。
(七)污染
在實(shí)際工作中，常見(jiàn)有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染(產(chǎn)物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標(biāo)本間交叉污染(如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的主要來(lái)源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。
由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。
1、測(cè)定分析前的污染源
測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。
2、測(cè)定分析階段的污染源
通常，測(cè)定分析階段的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。
在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。
3、污染的避免
要避免污染，先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述對(duì)工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。
為避免以前測(cè)定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照射，通過(guò)異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過(guò)程，所以這種方法也能防止污染。
上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然DNA的污染。
4、去除污染的措施
工作完后必須定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗(yàn)后長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面和其他表面；(3)實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。
(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析
擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測(cè)序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。
雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。
常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。
在擴(kuò)增后的雜交檢測(cè)中, 應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)給檢測(cè)信號(hào)的特異性帶來(lái)負(fù)面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑的離子強(qiáng)度是避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。
(九)質(zhì)量控制
質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面，即室內(nèi)質(zhì)量控制(以下簡(jiǎn)稱質(zhì)控)和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。
1、室內(nèi)質(zhì)量控制
必須對(duì)DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽(yáng)性和假陰性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于核酸擴(kuò)增測(cè)定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施。
(1)標(biāo)本制備： 常用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長(zhǎng)度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長(zhǎng)度平均范圍為30-40kb。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見(jiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。
快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對(duì)結(jié)果有疑問(wèn),就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現(xiàn)的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測(cè)定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對(duì)RNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計(jì)比色方法也不能對(duì)RNA的完整性下結(jié)論。
對(duì)于血清（漿）中病毒的測(cè)定，則要評(píng)價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標(biāo)本評(píng)價(jià)核酸提取方法的效果。
(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。
對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控方法也可采用外標(biāo)質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、β肌動(dòng)蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標(biāo)本制備時(shí)將外來(lái)內(nèi)標(biāo)加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會(huì)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。
對(duì)于DNA測(cè)定內(nèi)標(biāo)可使用對(duì)有機(jī)體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對(duì)于病原體的基因檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控每一擴(kuò)增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。
目前的商品試劑盒大部分沒(méi)采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此在測(cè)定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽(yáng)性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測(cè)臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測(cè)的效果。
使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測(cè)下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。
每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測(cè)質(zhì)控)，為判斷擴(kuò)增過(guò)程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。陰性標(biāo)本可以評(píng)估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量。
在擴(kuò)增靶RNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過(guò)這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。
(3)板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。
(4)測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾。
結(jié)果的報(bào)告必須簡(jiǎn)單清楚。定性測(cè)定報(bào)告“陽(yáng)性”或“陰性”即可。定量測(cè)定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測(cè)定方法線性范圍上限，則對(duì)樣本稀釋后再測(cè)，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測(cè)定范圍下限，則報(bào)告<多少即可，不能報(bào)告為“0”或“陰性”。
2、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)
所有開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果將作為其開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。
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